病理性瘢痕基因治療的研究現(xiàn)狀
病理性瘢痕主要包括增生性瘢痕和
瘢痕疙瘩，目前國內(nèi)外的研究尚未能很好地揭示其發(fā)病機制，臨床防治也存在較大困難，成為了醫(yī)學研究的難點和重點問題之一。近年來，隨著基因工程技術(shù)的研究進展，病理性瘢痕的基因治療成為研究的熱點，現(xiàn)就其研究現(xiàn)狀綜述如下。
1 細胞因子基因療法
目前的研究表明，各種細胞因子對創(chuàng)面愈合和瘢痕防治的作用不同，通過基因轉(zhuǎn)染、基因敲除等手段，針對這些細胞因子的作用進行干預，可以達到防治瘢痕的目的。
1.1 轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β） TGF-β在瘢痕形成及發(fā)展中起著非常重要的作用[1]。Choi等[2]以反義TGF-β1核酸轉(zhuǎn)染動物傷口，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在給予反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染抑制TGF-β功能后，傷口瘢痕形成顯著減少。liu等[3]用含有截短型TGF-β Ⅱ型（tTGF-βR Ⅱ）受體的腺病毒轉(zhuǎn)染新生大鼠背部線性傷口，檢測結(jié)果表明腺病毒介導的tTGF-βR Ⅱ可促進創(chuàng)傷愈合，減少瘢痕形成。
Ashcroft等[4]證實Smad3 缺陷的小鼠上皮再生加快，瘢痕形成減少。Gao等[5]證實針對Smad2的小干擾RNA轉(zhuǎn)染能減少瘢痕疙瘩成纖維細胞的I、Ⅲ型膠原分泌。提示通過對TGF-β下游分子Smad進行干預，也能對抗TGF-β促瘢痕形成作用。
1.2 肝細胞生長因子（HGF） HGF可抑制肝纖維化組織中TGF-β1的產(chǎn)生，增強膠原酶的活性。Ha 等[6]以腺病毒載體將人的HGF轉(zhuǎn)染兔耳增生性瘢痕，結(jié)果顯示實驗組瘢痕明顯縮小，膠原成分也較對照組減少，而且有更多的毛囊和汗腺結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。
1.3 結(jié)締組織生長因子（CTGF） CTGF在肝、腎、等器官纖維化中具有重要作用，是TGF-β的下游分子，能促進成纖維細胞的增殖和Ⅰ型膠原的表達[7]。
劉劍毅等[8]以脂質(zhì)體將CTGF反義寡核苷酸導入瘢痕疙瘩成纖維細胞（KFs），證實CTGF反義寡核苷酸能抑制細胞增殖，減少其膠原合成。然而目前針對CTGF進行的瘢痕基因治療尚缺乏體內(nèi)實驗研究。
1.4 腫瘤壞死因子α（TNF-α） TNF-α來源極為廣泛，包括各種免疫細胞、成纖維細胞等，TNF受體表達于除紅細胞外的所有體細胞和多種腫瘤細胞表面，TNF-α與其結(jié)合后參與炎性反應、免疫應答和抗腫瘤作用等。何威等[9]研究表明TNF-α對瘢痕疙瘩治療有效。Messadi等[10]通過實驗得到，瘢痕疙瘩使用TNF-α治療后，其成纖維細胞的NF-kappa B表達活性持續(xù)升高，誘導了成纖維細胞的凋亡。
1.5 致炎細胞因子 Xue 等[11]的研究證明，瘢痕疙瘩和增生性瘢痕的成纖維細胞中白介素-6（interleukin 6, IL-6）含量比正常皮膚高，Ghazizadeh[12]發(fā)現(xiàn)KFs的IL-6及其受體IL-6Rα和IL-6Rβ表達比正常皮膚成纖維細胞平均高6倍以上，用IL-6刺激正常皮膚成纖維細胞后，其膠原分泌增加，而以IL-6或IL-6Rα中和抗體處理KFs后，細胞膠原分泌明顯減少。
1.6 γ-干擾素(IFN-γ) IFN-γ主要由活化的T細胞和NK細胞產(chǎn)生，能以與細胞外基質(zhì)相連的形式存在，通過旁鄰方式控制細胞生長[13]。近年來其被臨床用于病理性瘢痕的治療，能抑制病理性瘢痕中瘢痕成纖維細胞增殖，下調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原基因的表達，并促進膠原酶的產(chǎn)生，可拮抗TGF-β的作用，是創(chuàng)傷修復與瘢痕形成過程中的一種比較明確的負性調(diào)節(jié)因子。Harrop[14]等研究證實，IFN-γ 可以誘導成纖維細胞凋亡，使肉芽組織和其后的瘢痕組織中成纖維細胞數(shù)量減少而逐漸成熟。人們將IFN-γ直接注入到增生性瘢痕中，可以明顯減小瘢痕的體積。Grantein[15]對8例瘢痕疙瘩患者采用雙盲試驗，結(jié)果表明用IFN-γ治療的瘢痕疙瘩高度平均減少30.4%，病理示表皮及真皮明顯變??；而安慰劑組瘢痕高度幾乎未減少。Larrabee等[16]也研究了用IFN-γ瘢痕內(nèi)注射治療瘢痕疙瘩和肥厚性瘢痕，結(jié)果發(fā)現(xiàn)10例中有5例瘢痕直徑減少了一半。
2 細胞凋亡基因調(diào)控
病理性瘢痕的形成過程中,成纖維細胞增殖凋亡調(diào)控失常及基質(zhì)分泌增多是其產(chǎn)生的根本原因，在瘢痕成熟過程中成纖維細胞數(shù)量的減少主要是由細胞凋亡引起的，病理性瘢痕中存在著細胞增殖和凋亡的異常，因此有研究者通過對凋亡相關基因的干預進行了瘢痕基因治療的研究。
2.1 P53 P53基因編碼一核蛋白，是最著名的抑癌基因。它結(jié)合和調(diào)節(jié)DNA修復、細胞分裂和細胞凋亡的基因表達[17]。Ladin等[18]肖志波等[22]將攜帶野生型P53基因的腺病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的KFs，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩的成纖維細胞的增殖被明顯抑制。通過對瘢痕疙瘩組織標本中的主要凋亡相關蛋白表達行免疫過氧化酶分析，發(fā)現(xiàn)18/20例中有P53表達,主要以核周方式分布于瘢痕疙瘩邊緣部的增生部位，認為P53調(diào)節(jié)異常可引起瘢痕疙瘩邊緣部增生區(qū)細胞增生和凋亡減少。王春梅等[19]對P53基因的外顯子4進行限制片段長度多態(tài)分析發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩和增生性瘢痕組織及體外培養(yǎng)KFs中均存在P53基因突變，P53基因突變可以使細胞處于一種增殖狀態(tài)，從而導致瘢痕疙瘩的形成。劉旺等[20]采用聚合酶鏈式反應——單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析方法和基因測序法，檢測各種組織成纖維細胞中P53基因的突變情況，發(fā)現(xiàn)瘢痕疙瘩中有9/12例P53基因外顯子4、5、6、7出現(xiàn)點突變和移碼突變,認為P53基因突變是瘢痕疙瘩形成和發(fā)展的重要因素之一。于冬梅等[21]在研究中發(fā)現(xiàn)，瘢痕疙瘩與增生性瘢痕中P53的mRNA高表達。
2.2 Fas(CD95)和FasL Fas(CD95)和FasL是已認識到的一對誘導細胞凋亡的重要膜蛋白因子，它們之間構(gòu)成一條獨特的細胞凋亡通路，參與了多種疾病的病理生理過程。陳偉等[23]通過實驗觀察到Fas和FasL在增生性瘢痕的表皮基底層細胞內(nèi)有少量分布，陽性細胞率顯著降低，提示增生性瘢痕的發(fā)生可能與Fas、FasL和Caspase-3蛋白表達降低、由這三種蛋白介導的細胞凋亡受阻相關。魯峰等[24]成功地構(gòu)建了攜帶Fas基因的重組腺病毒，感染后KFs能穩(wěn)定表達有功能的Fas蛋白，利用重組腺病毒轉(zhuǎn)染可以重建被阻斷的KFs Fas死亡信號傳導通道。
3 自殺基因治療
自殺基因又稱為前藥轉(zhuǎn)換酶基因,將一些病毒或細菌基因組中的前藥轉(zhuǎn)換酶基因?qū)肽[瘤細胞,這種基因可以編碼特殊的酶,將原先無毒性的前藥在腫瘤細胞中代謝為毒性產(chǎn)物,從而達到殺死腫瘤細胞的目的。自殺基因治療惡性腫瘤是利用轉(zhuǎn)基因方法將哺乳動物不含有的藥物酶基因轉(zhuǎn)入腫瘤細胞內(nèi)，其表達產(chǎn)物可將無毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細胞毒藥物，影響細胞的DNA合成，從而引起細胞死亡[25]。由于多采用病毒作為載體，故稱為病毒介導的酶解藥物前體療法。
自殺基因在腫瘤治療方面的研究已有多年的歷史，包括單純皰疹病毒胸苷激酶(HSV-TK) 基因、水痘帶狀泡疹病毒胸苷激酶(VZV-TK) 基因、大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶( EC-CD) 基因、大腸桿菌脫氧胸苷激酶(DCK) 基因、大腸桿菌黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶( GPT) 基因及細胞色素p450 基因。其中研究最深入、應用最廣泛的自殺基因系統(tǒng)首推胸腺嘧啶核苷激酶(thymidine kinase ，TK)基因/丙氧鳥苷(ganciclovir，GCV)胞嘧啶脫氨酶(cytosine deaminase, CD)基因/5-氟胞嘧啶( 5-fluorocytosine, 5-Fc)。
3.1 TK基因 TK基因編碼胸苷激酶，該酶可將核苷類似物(NA)代謝為二磷酸化物，后者在細胞內(nèi)酶的作用下成為有毒性的三磷酸化物，阻止DNA復制，導致細胞死亡，而發(fā)揮抗腫瘤作用。HSV-TK/GCV系統(tǒng)不僅能殺滅表達TK陽性細胞，而且通過旁觀者效應可以引起相鄰TK陰性細胞死亡，提高了基因治療的效率。肖生祥等[26]將HSV-TK/GCV系統(tǒng)應用于體外培養(yǎng)的成纖維細胞時，觀察到了其細胞毒性作用。柯正等[27]以攜帶胸苷激酶基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的KFs的同時應用前體藥物無環(huán)鳥苷，顯示了自殺基因療法對KFs的殺傷作用。
3. 2 CD基因
CD基因存在于一些細菌和真菌基因組中，哺乳動物細胞無此基因。目前研究最多的是大腸桿菌CD基因。CD基因編碼胞嘧啶脫氨酶，編碼的胞嘧啶脫氨酶可將胞嘧啶代謝為尿嘧啶，抑制脫氧胸苷酸合成酶，阻止脫氧尿苷酸
(dUMP)甲基化為脫氧胸苷酸（dTMP），從而影響DNA的合成。另外，5-Fu在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶核苷（5-FUR）后，也能摻入RNA 中干擾蛋白質(zhì)合成，對其他各期細胞也有作用。5-Fu作為一線化療藥物，用于消化道腫瘤、乳腺癌及婦科腫瘤等的化療，效果良好，整形外科也將其用于瘢痕的非手術(shù)治療方法之一
[28]。Kontochristopoulos等
[29]對20例
瘢痕疙瘩患者用5-Fu治療1周（局部注射，濃度50 mg/ml），隨訪12個月，超過85％患者有明顯效果。CD/5-Fc系統(tǒng)基因治療重要特點在于其旁觀者效應，其作用特點和機制類似于TK基因。
3.3 CD-TK雙自殺基因 單自殺基因療法用于治療腫瘤有很多優(yōu)點，但它也存在許多不足之處,如各類自殺基因系統(tǒng)治療腫瘤都存在一定程度的局限性，自殺基因治療腫瘤可能存在對腫瘤細胞類型的依賴性，因此不少學者探討雙自殺基因的應用研究。目前探究的雙自殺基因多為CD-TK基因，其產(chǎn)物同時具有兩種酶的活性，即CD和TK兩者的活性，可以產(chǎn)生互補的作用，大大提高其應用價值。研究表明，CD-TK雙自殺基因不需考慮自殺基因的腫瘤細胞類型依賴性，可以最大限度地消除腫瘤細胞對治療藥物的耐藥性，和放療合用，可大大增強腫瘤細胞對放療的敏感性，比單自殺基因療法具有更大的優(yōu)越性。宋悅等[30]CD-TK融合基因?qū)β殉舶┘毎辛己脷饔谩｜S宗海等[31]CD-TK融合基因體系可選擇性殺傷乳腺癌MCF-7細胞及血管內(nèi)皮細胞。徐斌等[33-35]聯(lián)合應用胸苷激酶基因和大腸桿菌胞嘧啶脫氨酶基因轉(zhuǎn)染KFs，發(fā)現(xiàn)在應用前體藥物后，KFs發(fā)生了明顯的凋亡，對瘢痕疙瘩具有強大的殺傷效應和旁觀者效應，顯示了良好的應用前景。亦通過實驗觀察到VEGF啟動子驅(qū)動的雙自殺基因治療系統(tǒng)對大腸癌LoVo細胞有確切的殺傷作用。蘇國強等[32]發(fā)現(xiàn)KDR基因啟動子調(diào)控的在體外實驗中發(fā)現(xiàn)。
4 展望
病理性瘢痕的基因治療為攻克瘢痕難題展現(xiàn)了良好的前景，但目前多停留在實驗室研究階段，因其生物安全性問題，致使瘢痕基因治療至今未能進入臨床治療實驗。如目前所應用的載體特別是病毒類載體，尚存在導致機體免疫反應、基因突變以及野生病毒毒力恢復等問題。加上創(chuàng)傷愈合和瘢痕形成是多因素參與的過程，單一因子的導入很難實現(xiàn)理想的治療效果；在瘢痕形成過程中，某一因子可能在某一特定階段過表達或下調(diào)才能發(fā)揮其抑制瘢痕形成的作用，而時間錯位的過表達或下調(diào)反而可能產(chǎn)生不利影響，使病理性瘢痕的研究和治療具有很大的復雜性和挑戰(zhàn)性，值得人們做進一步深入細致的研究，相信不久的將來人們會取得病理性瘢痕研究的更大成就。
整形十六科（瘢痕綜合治療一中心）供稿
